PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛運用于臨床和實驗室，用于擴增特定的DNA片段。它的基本原理就是在體外模擬細胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件，最終完成特定基因的體外復(fù)制。PCR實驗基本由變性、退火、延伸三個步驟完成。
1.變性。變性的目的是使模板DNA雙鏈解旋成為單鏈以便與引物結(jié)合，通常給它加溫至95℃（這是Taq酶進行30個左右的循環(huán)后活力不致受到過多損失時能耐受的最高溫度）。模板的變性對PCR成功與否至關(guān)重要，第一輪循環(huán)中變性時間往往為10min，然而根據(jù)經(jīng)驗，在其他各次的循環(huán)中一般以95℃持續(xù)30s（變性時間過長會損害酶活性）足以使各種模板變性。當(dāng)模板的G+C含量超過55%時則需要更高的變性溫度，可以選用來源于古細菌的DNA聚合酶，因為它比Taq酶更能耐受高溫。
2.退火。模板變性成單鏈后，溫度快速降至退火溫度，引物與模板DNA單鏈的互補序列可發(fā)生結(jié)合。退火溫度的選擇也至關(guān)重要，如果退火溫度太高，那么引物就無法與模板很好地結(jié)合，進而就會影響擴增效率；如果退火溫度太低，引物則會產(chǎn)生非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致非特異性DNA片段的擴增。退火30-60s便可使引物與模板之間結(jié)合。
3.延伸。模板-引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，沿著5’→3’的方向合成一條與模板DNA鏈互補的鏈。延伸時的溫度通常為72℃（Taq酶的最適溫度為72℃-78℃）。在最適溫度下，Taq酶的聚合速率約為2000bp/min。不過靶基因的每1000bp的擴增產(chǎn)物的延伸時間的設(shè)計時長為1min。另外，延伸時間隨擴增片段長短而定，甚至在所擴增目的基因的長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略。
重復(fù)循環(huán)“變性→退火→延伸"過程就可獲得更多的半保留復(fù)制鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴增。在最后一個循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-10min可使引物延伸，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。
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